转录组测序内参标准物质可作为测量标准，用于人转录组测序定性及定量领域，对转录组测序流程进行质量控制和定量结果的校准修正。

一、样品制备

本标准物质是体外转录获得的 100 个转录子 RNA，纯度检测合格后稀释至一定的浓度，并进行混合后分装为 2 套不同量值的混合物水平一（黄色管盖）和水平二（蓝色管盖），均包含 100 个 RNA。

二、溯源性及定值方法

采用经国际比对验证的同位素稀释质谱法对 100 个转录子 RNA 母液进行拷贝数浓度测定，并通过重量法计算得到标准物质的标准值。通过使用满足计量学特性要求、经确认的绝对定量测量方法和经检定/校准的容量计量器具，确保本标准物质的量值溯源至 SI 单位摩尔。

三、特性量值及不确定度（具体值见证书）

内参基因名称以 RNA 内参的编号-对应的人源基因（含融合基因、可变剪接、单碱基变异）名称表示，所赋特性量值的不确定度由定值测量、均匀性以及稳定性引入的不确定度分量合成得到。*水平一/水平二表示内参基因在水平一和水平二中的拷贝数浓度比值，其不确定度为水平一和水平二不确定度平方和的算术平方根。

四、均匀性及稳定性评估

参照 JJF1343 国家计量技术规范（等效 ISO 33405），采用数字 PCR 方法对该标准物质进行均匀性研究，结果表明均匀性良好，最小取样量为 4 μL。采用数字 PCR 方法对该标准物质进行了初步稳定性研究，参考同类标准物质的稳定性数据，自定值日期起，有效期暂定为 24 个月，研制单位将继续跟踪监测该标准物质的稳定性，有效期内如发现量值变化，将及时通知用户。

五、包装、贮存及使用

1. 包装规格：本标准物质采用 0.5 mL 立式拧口塑料离心管包装，一套包括水平一和水平二共 2管，每管 10 μL，其中水平一为黄色管盖，水平二为蓝色管盖。

2. 保存及运输条件：置于-70 ℃及以下冰箱中保存。采用干冰运输，收到后应检查是否处于冰冻状态，检查无误才可用于实验。

3. 本标准物质开瓶后一次性使用，避免反复冻融。使用时从冰箱内取出，平衡至室温并混匀后尽快用于建库。将标准物质水平一和水平二分别与两个不同待测样本进行混合，推荐用量为每 μg 总RNA 中加入 1~5 μL 水平一或水平二稀释液（稀释 50 倍），可根据总 RNA 浓度按比例调整体系，混匀后进行建库测序，测序数据量需≥6G/样本。本标准物质可兼容 PolyA 和 RiboZero 文库制备方案、Illumina 和 BGI 测序技术，仅适用于链特异性建库，不适用于普通转录组文库。

4. 对原始下机数据进行过滤质控后，需使用内参基因序列进行比对，序列文件（combined genome.fa.gz）及注释文件（combined genome.gtf.gz）可联系研制单位下载获取。

5. 利用本标准物质进行基因表达量分析，根据建库投入内参的绝对拷贝数对测序检出限及定量范围进行质控，利用不同内参在水平一和水平二中的拷贝数比值对待测样本基因表达相对定量进行质控。基于标准物质内参的建库投入量和测序观测的基因表达量建立标准曲线，可获得待测样本拷贝数表达谱，实现转录组测序绝对定量。详细方案可联系研制单位下载获取。